Hvordan forberede en hengende Drop

For å bestemme 3D-struktur av et protein , må du først en ren krystall av det. Den hengende - slipp-metoden bruker en dråpe proteinholdig oppløsning hengende fra en dekk . Under denne hengende dråpe ligger et reservoar med en høyere saltkonsentrasjon enn den for dråpe. Over tid forlater vanndamp dråpen og ender opp i reservoaret , slik at proteinet til å krystallisere . Hvert protein krever ulike forhold (for eksempel saltkonsentrasjon og pH ) , og ofte prøving og feiling tilbyr den eneste måten å finne de riktige conditions.Things du trenger
laboratoriefrakk, hansker og vernebriller
Mikropipette med pipette tips
1 molar løsning av natriumklorid i 0,05 molar acetatbuffer , pH 4,7
2 ml Eppendorf-rør (eller lignende)
Sentrifuge
24- brønns plate
vakuumfetti sprøyten
silikoniserte dekk
Trykkluft arkiv Pinsett
Clay (f.eks modelleire eller lignende)
50 mg /ml lysozym i 0,05 molar acetatbuffer løsning, pH 4,7
Vis flere instruksjoner

1

Sett på lab utstyr ( frakk , hansker og vernebriller ) .
2

Bruk en mikropipette å legge 1,1 ml av en natriumklorid (salt ) og acetatbuffer løsningen inn en Eppendorf rør.
3

Sentrifuger lukket Eppendorf rør med salt løsningen inni den i ca fem minutter ved 13000 rpm. Husk å balansere den sentrifuger ved å plassere et Eppendorf-rør inneholdende 1,1 ml vann over fra og motsatt til saltløsningenrøret.
4

Tilsett 1 ml av saltløsningtil en brønn i en 24 -brønns plate .
5

Bruk fettfylt sprøyte til å plassere et tynt lag av fett rundt kanten av denne brønnen. Pass på å ikke legge for lite eller for mye. Hvis du legger for mye fett , vil fettet renne ned i brønnen og muligens ødelegge eksperimentet. Hvis du bruker for lite , vil vel ikke være lufttett og eksperimentet vil ikke fungere . Målet for akkurat nok fett som dekkglass og fett danner en lufttett forsegling senere.
6

Rull leire med hendene for å lage fire små kuler , og presse dem inn på de fire hjørnene av 24- brønns plate . De vil fungere som støtte for å sikre dekning av platen ikke kommer i kontakt med dekkglass .
7

Bruk trykkluft for å blåse støv ut av dekkglass . Hold dekkglass med et par rene pinsett.
8

Suck opp 4 mikroliter av lysozym løsning med din mikropipette , og legge denne løsningen til sentrum av dekkglass . Endre pipetter , og legge til 4 mikroliter av saltløsning . Forsiktig pipettere opp og ned, suger inn fluidet og deretter fjerne det , for å blande saltløsningmed lysozym -løsning . Vær nøye med å blande de to uten å spre væsken over hele dekkglass .
9

Slå dekkglass over raskt , slik at væsken ikke glir av, og plante den holdent oppå også. Vær nøye med å trykke forsiktig på den slik at den danner en lufttett forsegling med fett rundt kantene av brønnen.
10

Skyv dekselet på 24-brønns plate på leire baller , og la platen på et kjølig sted .