Hvordan sette opp en frittliggende Patch - Clamp Experiment

The patch-clamp forsøket brukes til å måle enkelt levende celler . Den gjør dette med en veldig fin pipette holdt tett mot enkelt celle membran ( den ytre beskyttende dekke ) . Åpningen av denne pipette er bare omtrent 1 mikron (en tusendels millimeter ) og styres med et optisk mikroskop. Celler holdes ensartet i en skål ved bruk av en celle detacher , slik som trypsin . En bestemt celle blir valgt og pipettespissen er plassert på cellemembranen. En tett forsegling er dannet ved hjelp av sugekraft , og en del av membranen er trukket inn i de pipette.Things du trenger en Cell plate
Fosfatbufret saltvann eller PBS (uten kalsium og magnesium)
Trypsin
inkubator
10 - milliliter pipette
HEK (human epidermal keratinocyctes ) medium
Fetal kalveserum ( FCS )
Sentrifuger
ekstern opptaksløsning
Patch klemme chip
Twist cap
elektrode på
Vis flere instruksjoner
en

Skaff en plate for celler . Vask platen to ganger med 10 ml PBS ( fosfatbufret saltoppløsning ) uten kalsium og magnesium. Legg to milliliter detacher ( trypsin ) . Inkuber platen i tre minutter ved 37 grader Celsius. Observer plate under mikroskopet for å sikre at cellene er frittliggende. Beveg platen for å løsne alle celler fra bunnen av platen. Legg 10 milliliter HEK ( human epidermal keratinocyctes ) og FCS ( foster ku serum ) medium . Bruk en 10 - milliliter pipette å flytte cellene opp og ned .
To

Observer cellene under mikroskop for å sikre at de er enkeltceller . Pipette bruke 10 - milliliter pipette inntil cellene er singel , hvis det er nødvendig . Sentrifuger cellene for to minutter ved 1000 omdreininger i minuttet . Kast supernatanten. Plasser cellene i 10 ml kalvefosterserum . Sentrifuger cellene igjen i to minutter ved 1000 omdreininger i minuttet . Kast supernatanten. Plasser -celler i 200 mikroliter av ekstern opptak løsning . Observer cellene under mikroskop for enkeltceller med en glatt hinne .
3

Plasser saltvann inne i en patch clamp chip . Tilsett en dråpe intracellulære elektrolyttoppløsning til den nederste delen av brikken ved hjelp av en pipette. Monter chip på en vri cap . Det vri cap bør inneholde referanseelektrodeog sugerøret . Tilsett en dråpe ekstracellulær elektrolyttoppløsning til toppen av brikken ved hjelp av en pipette. Elektrolytten Løsningen åpner for å chip for å få kontakt med elektroden . Tilsett 5 mikroliter av cellesuspensjonen til saltoppløsningen i brikken . Plasser en enkelt celle ved hjelp av suge gjennom en pipette . Suge kan utføres manuelt ved å suge luft gjennom pipetten . Posisjonering av cellen øker motstanden for å danne en tetning . Forseglingen åpner for gransking av hele cellen .